第一章基因工程概述

详细讲解基因工程的含义、基因工程的理论基础及其研究的基本技术路线，介绍基因工程的研究发展史，基因工程在基础领域和应用领域中的研究内容及其研究发展前景。介绍基因工程药物、转基因植物和转基因动物，基因治疗及基因芯片等技术。

●1.1基因工程的概念与基本流程

基因工程就是指将一种供体生物体的目的基因与适宜的载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种受体生物体内，使之按照人们的意愿稳定遗传，并表达出新的基因产物或产生新的遗传性状的 DNA体外操作技术。

●1.2基因工程技术的诞生与发展

从20世纪40年代开始到70年代初，在微生物遗传学和分子遗传学研究领域中的理论上三大发现和技术上三大发明，对基因工程的诞生起到了决定性的作用。现在，基因工程技术已经广泛应用于生物体的遗传改良、生物反应器、基因治疗和基因疫苗的生产等，并带来了巨大的科学价值和经济效益。

●1.3基因工程的研究意义和应用

生命科学已经进入功能基因组时代。揭示人类基因组2.5万个基因在胚胎发育、器官形成、性状分化与维持、以及人类疾病发生中的功能与作用是功能基因组学研究的主要内容。现阶段国际上流行的基因功能研究的方法主要是从表达谱研究、基因突变、基因敲除、基因编辑、基因敲减或基因沉默、基因的过表达和异位表达以及基因的相互作用等方面来开展的。

第二章核酸的制备

通过回顾DNA的基本组成和结构，详细讲解DNA的提取和制备，重点讲述大肠杆菌染色体DNA及质粒DNA的提取方法。同时，详细介绍DNA的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR检测法的原理与操作。

●2.1天然DNA生物来源与总DNA的提取

介绍在自然界当中存在的诸如染色体DNA、线粒体和叶绿体DNA、质粒DNA、病毒和噬菌体DNA等一系列的天然DNA，并经过生物材料的准备、裂解细胞、分离和抽提DNA、DNA纯化与检测分析等步骤完成总DNA的提取。学生应该着重区分不同的DNA类型，掌握各实验步骤的基本原理。

●2.2质粒DNA的提取

介绍了质粒的基本特征，并以大肠杆菌为例讲解质粒DNA的提取过程。在对质粒DNA进行提取的过程中所使用的方法为碱裂解法，高碱环境破坏细胞壁及细胞膜，释放出其中的染色体DNA及质粒DNA并使得DNA分离为两条单链。质粒的特殊结构使得其两条单链相互缠绕无法完全分离。进而在恢复中性时达到分离的目的。

●2.3PCR

介绍了用于体外扩增DNA片段的技术，即聚合酶链式反应，也称为PCR反应。分别在PCR的发展、亲子鉴定中的应用、PCR的操作步骤等方面做出了讲解。PCR扩增主要包括变性、退火、延伸等三个过程。一个完整的PCR过程通常是由20-30个循环组成的。PCR的反应体系包括Taq DNA聚合酶、模板、引物、4种dNTP以及相应的反应环境。学生要熟悉PCR的过程及各步骤，能够提出各种PCR的改良方法，提高创新意识及能力。

●2.4琼脂糖凝胶电泳

讲授琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的原理，琼脂糖凝胶电泳中影响DNA迁移率的因素，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的操作方法和各种仪器设备。学生应注重利用问题探究式的方法对新课加以巩固理解，通过琼脂糖凝胶电泳技术新试剂、新技术的探讨，提高创新意识与能力。 介绍利用琼脂糖凝胶电泳的方法检测DNA片段，掌握loading buffer是由溴酚蓝和二甲苯氰这两种染料共同构成的，电泳时的泳动速率分别对应300bp及4kb大小的DNA片段大小。除此之外，电泳缓冲液保证了DNA片段的泳动，而EB染料则能够对DNA片段进行染色，便于观察。学生在掌握这一系列专业知识的同时，还应积极思考改良染色方式，减少EB污染，提高创新意识与能力。

第三章基因工程工具酶

讲授限制性内切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶等的性质及应用方法。重点讲授DNA片段化的方法。

●3.1分子手术刀——限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段，因其准确的DNA切割能力而被形象地誉为“分子手术刀”。

●3.2DNA分子片段化

讲授DNA分子片段化的概念与常用方法；各种酶切方法的原理与作用。加强学生对实验设计过程中图像的描述与分析能力。

●3.3基因缝合线——DNA连接酶

DNA连接酶，依赖腺苷三磷酸（ATP）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水解提供的能量，催化相邻的一条 DNA链的5'-磷酸基(5'-P)与另一条DNA链的3'-羟基（3'-OH）之间发生缩合反应生成磷酸二酯键，结果使断裂的DNA链重新接合，或使双链DNA上核苷酸之间因磷酸二酯键断裂而造成的裂口重新闭合。

●3.4其他基因工程工具酶

重点介绍DNA聚合酶类，包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Klenow大片段酶、耐热的DNA聚合酶Taq、T4噬菌体DNA聚合酶和逆转录酶等，以及末端脱氧核苷酸转移酶。

第四章基因克隆载体

略

●4.1基因克隆载体概述

本节讲授克隆载体的概念和应用以及各种载体的优缺点。重点内容是各种载体的优缺点，通过学习，能深刻理解各种克隆载体的不同以及如何在生产实践中应用。学习过程中要注重和实际生活的结合，克隆技术用途非常广，而一个好的载体大大提高克隆技术的效率。

●4.2质粒克隆载体

本节讲授了pBR322质粒克隆载体的构建过程和应用。通过三个不同的母本质粒，应用基因工程对其进行剪切修改，最终达获得比较满意的pBR322质粒克隆载体，深刻理解质粒上每个部件的作用。学会用双抗筛选法筛选重组子，并能理解每一步的原理。在学习pBR322质粒克隆载体的构建过程中还需要提高自己的创新能力，学习如何利用现有条件创造出新的产品。本节讲授了pUC18/19质粒载体的构建过程和应用。同时，通过本节学习，应该掌握pUC18/19质粒载体上各个元件的作用，并深刻理解如何利用这些元件进行基因克隆。其中蓝白斑筛选是重点，也是难点，学生应理解此方法的巧妙之处。学会利用TA克隆技术克隆PCR产物，为以后的实验打下理论基础。

●4.3病毒（噬菌体）克隆载体的构建和应用

本节以λ噬菌体为例，讲了病毒（噬菌体）克隆载体的构建过程及其应用。病毒生活周期比质粒要复杂，首先要理解野生型病毒各个基因的作用以及生活周期，在此基础上要理解人类改造病毒所做的工作。学生还要学会如何利用病毒（噬菌体）克隆载体进行基因克隆。通过学习，从微观层次上深刻理解人类对大自然的改造。

●4.4Cosmid克隆载体的构建和应用

本节讲了Cosmid克隆载体的构建过程和应用此载体进行大片段基因的克隆。Cosmid克隆载体自然中没有原型，完全是人类利用对质粒和病毒的了解构建的一个新型载体。首先要理解载体上各个元件的功能以及在克隆过程中各自的作用。其次通过学习，能理解此载体的创新之处，提高自己的创新意识。

●4.5人工染色体克隆载体

本节讲授了人工染色体克隆载体的构建和应用。人工染色体克隆载体就是人类模仿天然染色体，给一段DNA序列加上端粒序列、着丝粒序列、自主复制序列，这样这段DNA就可以在细胞中稳定存在并分配到子代中。这种载体最大的特点就是可以克隆长片段DNA，远远高于前面我们学到的几种载体，同时可以稳定的存在于真核细胞中。需要学生理解由此产生的优势和用途。

第五章目的基因的获取与制备

讲授基因组文库、cDNA文库的概念和构建方法。从基因文库中筛选分离目的基因的方法。几种特殊PCR 的原理。

●5.1从基因文库获取目的基因

从复杂基因组中分离未知蛋白基因时，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，难以直接分离得到。因此，为了解决这个难题，一种可行的方法就是将目的基因进行扩增，增加其分离的可能性。而由于待分离的基因是未知基因，难以直接进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建基因文库，然后选择一定的方法将所需的克隆子筛选出来，最后分离得到目的基因。

●5.2PCR获取与扩增目的基因

聚合酶链式反应-PCR技术已广泛用于目的基因的扩增和分离。如果已知目的基因的全序列或其两侧序列，可以通过合成一对与模板DNA互补的引物，有效地扩增所需的DNA片段。

第六章重组基因导入受体细胞

讲授受体细胞选择的基本原则，基因工程中常用的受体细胞的类型及其优缺点。重点讲述重组DNA分子转入原核生物细胞和真核生物细胞的方法及重组子的筛选的基本方法。

●6.1目的基因导入大肠杆菌

讲授目的基因转化大肠杆菌的钙离子诱导转化法与电穿孔转化法，并对二者实验操作技术与转化效率进行对比。

●6.2目的基因导入植物细胞

讲授农杆菌介导的Ti质粒载体转化法的原理和基本步骤。就重组DNA分子导入植物细胞方法进行分析和讨论，体会需求推动发展的普遍规律；发展科学探究能力，培养学生学会找到问题的关键点；作出假设和预期；设计可行的实验方案的能力。

●6.3阳性转化子的鉴定

讲授重组子筛选的一般原理与方法。讲授重组子的抗药性筛选，显色互补筛选，DNA序列测定以及Southern Blot检测方法的原理与操作。学生应注重体会多角度思维在科研实验设计思路中的重要性。通过知识的前后联系，明确知识体系的概念，并初步尝试构建本学科知识体系。

第七章外源目的基因表达与调控

讲授原核生物和真核生物中几类有代表性的基因表达系统的特性及基因表达产物的检测与分离纯化的方法。教学重点是基因表达产物的多种检测技术。

●7.1基因表达产物的免疫沉淀法检测

讲授外源基因表达产物蛋白质的免疫沉淀法的原理，操作方法，应用领域。

●7.2基因表达产物的酶联免疫吸附法检测

讲授外源基因表达产物蛋白质的酶联免疫吸附法的原理，酶联免疫吸附法的分类，操作方法，应用领域。

●7.3基因表达产物的的SDS-PAGE检测

讲授SDS-PAGE法分离蛋白质与测定蛋白质相对分子量技术的原理及操作技术。学生应注重利用问题探究式的方法对新课加以巩固理解。通过SDS-PAGE新试剂、新技术的探讨，提高创新意识与能力。

●7.4基因表达产物的Western 印迹分析

讲授Western Blot检测法的原理、步骤和操作方法。培养学生对同类实验技术的原理与用途差异的比较分析，归纳总结的能力。