第一章绪论

制药工业包括生物制药、化学制药和中药制药三个领域，生物药物、化学药物和中药是人类防病治病的三大药源。制药过程包括原料药和制剂加工，其中原料药的生产包括上游加工和下游加工。制药分离过程即下游加工过程。制药分离技术包括机械分离和传质分离两大类。传质分离又分为平衡分离和速率分离。这些分离过程依据的原理不同。对不同的分离方法和设备，分离过程和产品可以通过相应的指标进行评价。

●1.1药物的分类

生物药物、化学药物和中药是人类防病治病的三大药源。生物药物是来源于生物体的各种天然生物活性物质及人工合成或半合成的天然物质类似物。化学合成药则指通过化学全合成或半合成制备的单一成分，结构明确的药物。中药则以天然植物药、动物药和矿物药为主，在中医药理论指导下使用。

●1.2制药过程

制药过程包括原料药和制剂加工，其中原料药的生产包括上游加工和下游加工。下游加工过程即目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。是制药过程不可缺少的重要环节。生物产品的特殊性、复杂性、和严格的质量要求，导致下游加工过程的成本一般占整个生物加工过程成本的大部分。

●1.3制药分离技术原理与分类

制药分离是根据待分离物系中有效活性成分与共存杂质在物理和化学性质方面的差异，选择合适的分离方法，制定合理的工艺流程和操作条件，设计或选择适当的设备，完成分离纯化，使其成为高纯度的、符合药品标准的原料药。制药分离技术包括机械分离和传质分离两大类。传质分离又分为平衡分离和速率分离

●1.4分离效率的评价

分离效率可从两个方面来评价：（1）分离方法和设备和（2）分离过程和产品。针对分离方法和设备的评价指标包括：分离容量、分离速度和分辨率。对分离过程和产品的评价指标包括：浓缩程度、分离纯化程度和回收率。

第二章固液分离技术

制药生产中广泛应用的固液分离技术主要包括过滤、离心分离和重力沉降。无论原料药、成药及辅料都离不开固相与液相的分离。如从发酵液中去除或回收微生物细胞及从细胞破碎液中提取有效成分，就是典型的固液分离过程。

●2.1细胞分离-离心

离心分离是利用离心力为推动力分离液相非均一物系的过程。离心方法包括：差速离心和区带离心。影响离心沉降速度的因素包括颗粒粒径、离心机转数和离心半径、料液粘度等。工业离心设备包括：碟片式离心机、管式离心机和平板式离心机等。

●2.2细胞分离-过滤

过滤是利用薄片形多孔介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。过滤操作以压力差为推动力。滤液的透过阻力主要来自于滤饼阻力。对料液进行絮凝或凝聚等预处理可以提高过滤速度。工业过滤设备主要包括：板框过滤机、真空过滤机和加压叶滤机等。

●2.3细胞破碎技术

当目标产物存在于细胞内时，需要回收细胞并对细胞进行破碎从而提取目标成分。细胞破碎方法可以分为机械法和非机械法两大类。机械破碎法主要包括高压匀浆法、珠磨破碎发、喷雾撞击破碎法和超声破碎法；非机械法主要包括化学破碎法和物理破碎法。在细胞内存在的许多种物质中，破碎细胞时应选择性释放目标产物、而使其它物质尽量少地释放出来。

第三章初级分离

初级分离是指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。常用的初级分离技术包括离心、过滤、膜分离、萃取、吸附、沉淀分级和泡沫分离等。

●3.1盐析沉淀

盐析是蛋白质在高离子强度溶液（或高浓度电解质溶液）中溶解度降低，发生沉淀的现象。离子强度使蛋白质表面双电层变薄和水化程度降低。蛋白质的溶解度与离子强度之间的关系可通过用Cohn经验方程表示。无机盐种类、无机盐浓度和蛋白质初始浓度、温度和pH对盐析过程有影响。

●3.2盐析操作及应用

蛋白质盐析最常用的盐析剂是硫酸铵。需要通过实验确定沉淀目标蛋白质所需的最佳硫酸铵饱和度。通常采用分段盐析的方式进行蛋白质的分离纯化。盐析沉淀广泛用于各类蛋白质的初步纯化和浓缩。在某些特殊情况下还可用于蛋白质的高度纯化。

●3.3有机溶剂沉淀

有机溶剂沉淀是向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等亲水性有机溶剂，降低溶液介电常数，并造成蛋白质分子表面水化程度降低，从而发生沉淀的方法。常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇等。有机溶剂的种类及用量、温度、pH值、样品浓度、离子强度等均会影响沉淀结果。改变有机溶剂的种类和浓度,可分离蛋白质混合物,即有机溶剂分级沉淀。

●3.4等电点沉淀与热沉淀

等电点沉淀是利用蛋白质是两性电解质的特性，在等电点时，分子中的正电荷与负电荷数目相等，蛋白质分子净电荷为零，分子间静电排斥力最小，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出。热沉淀是利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀的现象，根据蛋白质间热稳定性的差别，分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法。

第四章膜分离

膜分离是以选择性透过特性的膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力，使料液侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。生物产物的分离中最常用的膜分离技术：超滤、微滤和反渗透、透析。

●4.1膜分离方法及原理

膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的。微滤，超滤，纳滤和反渗透为压力驱动膜分离过程；透析为浓差驱动膜分离。在四种压力驱动膜分离过程中，反渗透膜的孔径最下，操作压力最大，透过物为水、溶剂，截留物为溶质和盐，适用于1nm以下小分子（盐、氨基酸、糖）的浓缩。微滤膜孔径较大，适用于悬浮液（菌体细胞、胶体颗粒和悬浮微粒子）的分离。超滤膜膜孔径：0.001-0.05um，比MF膜小。适用于处理不含固形成分料液，分离或浓缩1-50nm的生物大分子。纳滤膜孔径为纳米级（1-2nm），主要用于截留分子量为100-1000左右的物质，可以使一价盐和小分子物质及溶剂分子透过。

●4.2膜材料及特性

按膜结构可分为对称膜和不对称膜。不对称膜又分为一般不对称膜和复合膜。按膜层结构是否有透孔可分为有孔膜和无孔膜（致密膜）。根据按膜材料不同，可分为天然高分子膜、合成高分子膜、无机材料膜。膜材料、生产工艺和膜孔径影响水通量大小。

●4.3膜组件

膜组件是由膜、固定膜的支撑体、间隔物及收纳这些部件的容器构成的一个单元，也称为膜装置。商品化膜组件的类型主要包括管式、平板式、螺旋卷式、中空纤维（毛细管式）。中空纤维膜组件比表面积最大，可方便地进行反洗，造价低,工业普遍使用。

●4.4影响膜分离速度的因素

操作形式、流速、压力和料液浓度是影响膜分离速度的主要因素。膜分离采用错流过滤形式，料液流向与膜面平行，可大大减轻浓度极化或凝胶极化现象， 使透过通量维持在较高水平，可连续工作，高于终端过滤。流速主要影响传质系数k，从而影响透过通量。压力较小时，无浓度极化现象发生，透过通量与压力呈线性关系。料液浓度与透过通量呈负相关。

●4.5膜的污染与清洗

膜污染是膜技术应用的最大限制因素，是膜分离过程中遇到的最大问题。膜污染会导致透过通量大幅度下降， 目标产物回收率降低，膜的使用寿命大大缩短。膜的清洗方法包括物理清洗和化学清洗。优先考虑水洗。在膜系统的长期运行过程中，污染和清洗是一个动态平衡过程。膜的有效清洗是延长膜使用寿命的重要手段。

第五章萃取

萃取是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作，属初级分离技术。萃取技术包括传统有机溶剂萃取，及后续发展起来的液膜萃取、双水相萃取、反胶团萃取和超临界流体萃取。

●5.1萃取基础理论

根据萃取剂与溶质间是否发生化学反应，萃取可分为物理萃取和化学萃取。溶质的分配遵循分配定律。萃取过程中常用溶质在两相中的总浓度之比表示溶质的分配平衡，该比值称为分配系数。萃取因子和分离因子是衡量萃取效率的主要指标。

●5.2有机溶剂萃取

生物产物分离中有机溶剂萃取可用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物的提取。水相pH值、温度和无机盐是影响萃取的主要因素。萃取剂选择的基本要求是有很大的萃取容量和良好的选择性。工业萃取设备包括混合澄清式萃取器和塔式萃取器。混合澄清式萃取又分为单级和多级萃取，其中多级萃取包括多级错流萃取和多级逆流萃取。

●5.3双水相萃取

将种不同的亲水性高分子聚合物的水溶液或亲水性聚合物水溶液与盐溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，会形成双水相体系。常见的双水相体系包括高聚物/高聚物体系（如PEG/Dx）和聚合物/无机盐体系。双节线图是描述双水相形成的条件和定量关系的曲线。影响蛋白质在双水相分配平衡的因素包括：成相聚合物种类(分子量)与浓度、成相无机盐种类与浓度、外加电解质(无机盐)种类与浓度、)pH和温度。

●5.4反胶团萃取

反胶团萃取是利用表面活性剂在有机相中形成反胶团，使生物分子溶解在反胶团的亲水微环境中。反胶团溶解蛋白质的形式，有四种模型。对亲水性蛋白质，普遍接受水壳模型。静电相互作用是生物分子溶解于离子型表面活性剂的反胶团相的主要推动力。水相pH和离子强度(盐浓度)与静电作用力相关。

第六章吸附分离技术和理论

吸附分离是利用固体吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面,以除去有害成分或分离回收有用目标产物的过程。根据吸附剂对溶质的吸附作用力的不同，可以分为物理吸附、化学吸附和离子交换吸附。在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换法。

●6.1吸附分离介质--吸附剂

吸附剂是指表面能发生吸附作用的固体，一般为多孔微粒或多孔膜，具有较大比表面积，也称吸附介质。吸附剂包括多孔型和凝胶型两大类。活性炭是经典的多孔型吸附剂。凝胶型吸附剂包括：多孔性纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。影响吸附的因素包括：吸附剂的特性、吸附物的性质、吸附的条件（pH、温度、盐浓度）和吸附物浓度与吸附剂用量等。

●6.2吸附分离介质--离子交换剂

按功能基团不同，离子交换剂可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。离子交换剂一般由惰性不溶性载体或固体基质（骨架）、与骨架相连的功能基团或活性基团或配基和平衡离子组成。阳离子交换剂包括强酸性和弱酸性，阴离子交换剂包括强碱性和弱碱性。根据骨架材料不同,离子交换剂可分为离子交换树脂、离子交换纤维和凝胶型离子交换剂。离子交换的操作方式包括静态和动态洗脱两种。

●6.3吸附操作

常用的吸附和离子交换操作设备为固定床吸附设备-吸附塔。包括单柱固定床吸附操作和多柱串联的固定床吸附操作。多柱串联固定床吸附操作在整个进料过程中进料(吸附)从未间断，流体流动更接近平推流,反混小,吸附效率高。此外，流化床和膨胀床也用于吸附操作。

第七章液相色谱

色谱法又称层析法。属高度纯化技术。色谱法分离精度高、设备简单、操作方便。适用于终产品纯化。色谱法可用于物质成分的定量分析与检测及生物物质的制备分离和纯化。用液体作为流动相的色谱称为液相色谱。

●7.1色谱原理与分类

根据混合物中各物质的分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、疏水性等的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，以不同的速度移动，而达到分离技术。根据流动相状态、固定相形状、操作压力和流动相方向、分离操作方式、分配机理等进行分类。根据分配机理，可以分为凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱、吸附色谱和反相色谱。

●7.2凝胶过滤色谱

凝胶过滤色谱又称凝胶排阻色谱, 分子筛过滤等。利用凝胶粒子（凝胶过滤介质）为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。凝胶过滤色谱的重要参数包括：柱体积、空隙体积、内水体积和洗脱体积。洗脱速度取决于分配系数。当料液体积小于两者洗脱体积之差时，两种物质才可能得到完全分离。GFC的分离精度有限,料液处理量也有限。常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和脱盐。凝胶过滤介质包括葡聚糖系列、琼脂糖系列和聚丙烯酰胺系列。

●7.3离子交换色谱

离子交换色谱是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。凝胶过滤介质（骨架）键合上离子交换基（功能基团）即制成相应的离子交换剂。用于蛋白质分离的离子交换剂的介质：Sephadex、Sepharose 等系列。离子交换色谱常采用梯度洗脱法，又分为线性梯度洗脱法和逐次洗脱法(阶跃梯度洗脱法)。基本步骤包括平衡、上样吸附、洗涤、洗脱和再生。

●7.4疏水性相互作用层析

利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。吸附在高浓度盐溶液中进行 （略低于盐析点的盐浓度），洗脱主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。

第八章电泳

电泳是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。电泳法的分辩率高,属高度纯化技术。电泳需要外加电场的作用，设备放大难，多用于分析。电泳技术根据根据原理和操作形式可分为：区带电泳、等电点电泳和等速电泳。根据是否使用凝胶载体可分为凝胶电泳和自由流电泳。区带电泳可分为:板式电泳和柱式电泳。

●8.1电泳基础理论

自由溶液中的电泳速度与溶质电荷数、电场强成正比，与溶质半径和溶液粘度呈反比。影响电泳迁移速度的因素包括：样品性质、电场强度、缓冲液的性质、电渗和温度。

●8.2凝胶电泳

凝胶电泳是利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离。相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大，泳动速度较慢，而小分子溶质泳动速度较快。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。

●8.3等电点聚焦电泳

等电点聚焦是利用具有连续pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相应的等电点位置上，形成具有不同等电点的蛋白质区带。等电点聚焦电泳的分辨率高，可消除分子扩散引起的分离度下降，电泳区带相当狭窄。特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子，重复性好。

第九章亲和色谱

亲和色谱法又称亲和层析，是将相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。

●9.1生物亲和作用

生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用。参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。常见的亲和作用体系包括酶与底物，抗原与抗体等。亲和作用体系分为高度特异性体系和大多数亲和体系。

●9.2亲和色谱原理

利用键合了亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，不同蛋白质分子对固定化在载体上的亲和配基具有不同的识别和结合能力，根据亲和吸附作用力的差异，使目标产物得到分离纯化的液相色谱法。

●9.3亲和色谱分析过程

亲和色谱操作过程包括：进样、吸附、清洗、洗脱和再生。亲和色谱操作中可能存在的两种吸附亲和吸附和非特异性吸附。清洗的目的是洗去色谱柱空隙和吸附剂内部存在的杂质。洗脱包括特异性洗脱和非特异性洗脱。亲和色谱的优点是纯化过程简单、迅速；分离效率最高，条件温和。