绪章临床分子生物学检验技术

分子生物学技术的迅速发展，有力地助推着临床医学向预测医学、预防医学、个体化医学和参与医学为特征的现代医学发展，使临床医学对于疾病检验诊断的理念与方法发生了革命性变化。用分子生物学技术分析疾病基因、从分子水平分析疾病发生原因、跟踪疾病发展过程、检测感染人类的病原微生物以及根据基因多态性分析进行疾病的风险预测、个体化用药的有效性与安全性评价已迫在眉睫。为适应这种快速发展的需要，我们将开始学习临床分子生物学检验技术这一门学科，在绪论部分，我们将从课程学习方法，整个课程梗概为同学们提供一个整体的轮廓，为以后进一步的各论的学习打好基础。

●0.1临床分子生物学检验技术分类及学习方法指导

20世纪50年代，沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构，开创了现代分子生物学学科，为揭开人类生命现象的本质和疾病机制奠定了基础。21世纪以来，以分子克隆、基因扩增、基因测序、基因敲除、印迹杂交、生物芯片、双向电泳为代表的分子生物学技术的迅速发展，为破解生命奥秘、探究疾病现象等奠定了扎实的基础。

第一章 临床分子生物学检验标志物

生物标志物在临床实践中具有重要的应用价值。分子生物标志物是生物标志物的一种类型，包括核酸、蛋白质和代谢产物等多种类型。目前，在临床上应用最为广泛的为核酸分子生物标志物，包括最常见的基因突变、基因多态性位点以及DNA甲基化、线粒体DNA和DNA含量的变化等。RNA也可以作为分子生物标志物，包括mRNA、选择性剪接转录本、miRNA以及长链非编码RNA等。随着分子生物学检测技术的发展，循环核酸也称为重要的分子生物标志物，特别是在肿瘤的早期诊断和产前诊断中将具有重要的应用前景。目前，高通量技术在分子生物标志物的发现中起到核心作用，但是通过高通量技术筛选的分子生物标志物要在临床上应用，需具备一定的特征，如检测技术的可行性、灵敏度、特异性、预测能力和风险等。

●1.1分子生物标志物的概念与分类

1976年，简悦威应用DNA分子杂交技术进行了α地中海贫血的诊断，标志着基因诊断技术的诞生，基因诊断就是利用分子生物学技术对核酸的结构及其表达产物做出分析。

●1.2基因组和基因组特征

基因指可以转录RNA的DNA片段，基因从产物也可以是蛋白质和RNA。基因组是指整个生物体的全套遗传信息，包括所有基因和基因间的区域。人类基因组计划和其他物种基因组计划的实施和完成，提高了生命科学研究的技术水平，改变了研究的模式，开辟了许多新的研究领域，深刻影响着医学、生命科学乃至人类文明的大发展。

●1.3 基于基因突变的分子生物标志物

目前，临床上应用的生物标志物的发现，主要基于生理学、生物化学等生物学机制而发现，因此每次检测只针对一个或几个标志物。随着新的分子生物技术的出现，如基因组学、转录组学和蛋白组学等高通量技术的发展，使得生物标志物的发现不再依赖于对疾病机制的详细了解，可以通过一次性筛选大量的生物分子，从而大大加速了分子标志物的发现速度。

第二章核酸杂交技术

单链的核酸分子在合适的条件下，与具有互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称作核酸分子杂交。不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成新的双链分子。利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称为核酸分子杂交技术。核酸分子杂交技术目前广泛应用于分子生物学、生物化学、病毒检测、疾病诊断、基因工程等学科领域中，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。

●2.1核酸分子杂交的概念

核酸分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。核酸分子杂交可在DNA与DNA、DNA与RNA或RNA与RNA的两条单链之间进行。杂交过程是高度特异的，可以根据所使用的探针序列进行特异性的靶序列检测。

●2.2经典的核酸分子杂交技术

分子杂交实验依据其形式的不同可以分为液相杂交、固相杂交、原位杂交，固相杂交又可以分为菌落杂交、点杂交、反向点杂交、Southern印记杂交和Northern印记杂交，各型杂交的基本原理和步骤基本相同，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。

第三章核酸体外扩增及定性检测技术

自从1953年沃森和克里克发现了DNA 双螺旋结构以来，人们对核酸的研究逐步深入。1985年K.Mullis等建立了体外DNA扩增技术---聚合酶链反应（PCR）技术，该技术模拟体内核酸合成过程，能够快速方便地获得大量特异拷贝的核酸片段。本章节具体介绍了如下的内容包括了聚合酶链反应的基本原理和过程、反应体系组成和扩增参数，逆转录PCR、多重PCR、巢式PCR、转录依赖扩增、链置换扩增、bDNA扩增技术的原理及临床应用，靶序列扩增、探针序列扩增和信号扩增等。

●3.1 PCR技术

PCR技术-讲述PCR扩增技术原理及基本过程；PCR反应体系及扩增参数。引物的设计原则-讲述PCR中引物的设计的原则及如果在实际过程中设计引物。

●3.2其他PCR技术

其他PCR技术-介绍R-FRLP、PCR-ASO、PCR-SSCP等PCR产物分析原理及主要临床应用。

●3.3PCR产物分析

PCR产物分析-PCR产物分析是为了判断PCR扩增的有效性和正确性、对产物进行定量分析以及对PCR产物进行序列分析。

●3.4PCR实验操作

PCR实验操作-将理论联系实际，以实际的操作为例直观的为大家讲述如何进行PCR实验的操作。

第四章核酸定量检测技术

1996年，美国Applied Biosystems公司首次推出实时荧光定量PCR技术，所谓实时荧光定量PCR技术。本章将介绍如下内容：实时荧光定量PCR技术的基本原理，引物、探针的设计基本原则，实时荧光定量PCR相关结果的分析方法，实时荧光定量PCR反应体系和条件的优化。

●4.1实时荧光定量PCR的基本原理

实时荧光定量PCR的原理及常用的概念--介绍实时荧光定量PCR中常用的概念；PCR扩增的理论模式。荧光染料技术和荧光探针技术--介绍实时荧光定量PCR中的荧光化学物质及两种实时荧光定量PCR技术荧光染料技术和荧光探针技术

●4.2实时荧光定量PCR引物和探针的设计原则

实时荧光定量PCR引物和探针的设计原则--介绍实时荧光定量PCR引物设计的基本原则和探针设计的基本原则。

●4.3实时荧光定量PCR测定的数据分析

实时荧光定量PCR测定的数据分析--介绍实时荧光定量PCR测定的数据分析，两种方法相对定量和绝对定量。

●4.4实时荧光定量PCR的实验操作

实时荧光定量PCR的实验操作--介绍实际的实时荧光定量PCR操作过程。

第五章核酸序列分析

DNA测序技术是分子生物学三大基本技术之一。测定并分析核酸的序列，是研究其结构、功能及其相互关系的前提，是分子生物学最基本的课题，并为临床疾病的分子诊断提供最精确的判定依据。链末端终止法和化学降解法是传统的、经典的两种DNA测序技术，其中链末端终止法是目前最通用和有效的方法。

●5.1一代DNA测序技术

自Sanger的双脱氧链终止法发明以来，DNA测序方法一直都在改进，但该方法都是后来众多测序技术的基石，这些技术统称为第一代DNA测序技术，目前仍被广泛应用。

●5.2临床样本处理与核酸提取

在分子生物学检验过程中，临床标本的收集、运送和保存，以及核酸、蛋白质的分离纯化对检验结果的准确性具有决定性的影响。因而，临床标本的处理和分离纯化是分子生物学检验的关键步骤，也是分子生物学检验的基础工作。

第六章病毒病的分子生物学检验

病毒是由核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成非细胞形态的简单生命体。本章将介绍如下内容病毒病的分子生物学检验策略（一般性检出策略和完整性检出策略），常见病毒的基因组结构特征、基因分型依据、分子生物学检验内容。包括乙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒；人乳头瘤病毒；人类免疫缺陷病毒等。

●6.1乙型肝炎病毒的分子生物学检验

乙型肝炎病毒的基因组结构特征--介绍乙型肝炎的基因组结构特征；乙型肝炎病毒的分子生物学检测方法--介绍乙型肝炎病毒的分子生物学检测的方法哪些；乙型肝炎病毒分子生物学检验的临床意义--阐明乙型肝炎病毒分子生物学检验的方法有哪些。

●6.2丙型肝炎病毒的分子生物学检验

丙型肝炎病毒的分子生物学检验--介绍丙型肝炎病毒的基因组结构特征，分子生物学检测方法以及分子生物学的检验的临床意义。

●6.3人乳头瘤病毒的分子生物学检验

人乳头瘤病毒的分子生物学检验--介绍人乳头瘤病毒的基因组结构特征，分子生物学检测方法以及分子生物学的检验的临床意义。

●6.4人类免疫缺陷病毒的分子生物检验

人类免疫缺陷病毒的分子生物检验--介绍人类免疫缺陷病毒的基因组结构特征，分子生物学检测方法以及分子生物学的检验的临床意义。

第七章结核的分子生物学检验

除了病毒感染性疾病外，另一大类就是由细菌感染所导致的细菌感染性疾病。细菌感染性疾病的分子生物学检验是指利用分子生物学的方法对病原菌的特异性生物大分子进行检测，为疾病的诊断、治疗提供信息。相比较于传统方法，细菌感染的分子生物学方法具有多方面的优势：比如可以快速检测不能培养或者不易培养、生长缓慢的病原菌；还可以用于对细菌进行基因分型，有利于病原菌的鉴定和分子流行病学调查；同时，对于病原菌耐药基因的检测，为细菌感染性疾病的临床诊治、疗效评价提供科学依据等。可以说，细菌的分子生物学检验对于临床细菌感染的及时治疗及有效治疗具有重要意义。本章主要介绍目前应用较为成熟的分子生物学技术在细菌感染的广谱分子生物学检测中的应用。

●7.1结核分枝杆菌的概述和基因组结构特征

1882年，德国科学家Koch发现结核分枝杆菌（TB），并证明是结核病的病原体。据WHO统计，目前世界上有1/3的人感染了TB，每年有800万新患者出现，约300万人死于肺结核，同时TB耐药菌株的不断出现和传播造成TB耐药率不断上升，给结核病的治疗和控制带来严重的挑战。本节主要介绍利用分子生物学技术达到快速、灵敏、特异检测TB的目的，用于TB感染的临床快速诊断及抗结核的用药指导。

●7.2结核分枝杆菌的分子生物学检测方法

1882年，德国科学家Koch发现结核分枝杆菌（TB），并证明是结核病的病原体。据WHO统计，目前世界上有1/3的人感染了TB，每年有800万新患者出现，约300万人死于肺结核，同时TB耐药菌株的不断出现和传播造成TB耐药率不断上升，给结核病的治疗和控制带来严重的挑战。本节主要介绍利用分子生物学技术达到快速、灵敏、特异检测TB的目的，用于TB感染的临床快速诊断及抗结核的用药指导。

●7.3TB分子生物学检验的临床意义

1882年，德国科学家Koch发现结核分枝杆菌（TB），并证明是结核病的病原体。据WHO统计，目前世界上有1/3的人感染了TB，每年有800万新患者出现，约300万人死于肺结核，同时TB耐药菌株的不断出现和传播造成TB耐药率不断上升，给结核病的治疗和控制带来严重的挑战。本节主要介绍利用分子生物学技术达到快速、灵敏、特异检测TB的目的，用于TB感染的临床快速诊断及抗结核的用药指导。

第八章真菌及其他感染性疾病的分子生物学检验

感染性疾病是人类常见的一大类疾病，由病原生物感染集体所致，主要包括细菌、病毒、真菌、原虫等病原体感染，严重的威胁人类健康。本章内容主要阐述衣原体（沙眼衣原体、肺炎衣原体）、支原体（肺炎支原体、解脲脲原体）、梅毒螺旋体和原虫（弓形虫和疟原虫）的基因组结构特征和分子生物学检验方法以及分子生物学检验方法的临床意义。

●8.1衣原体的分子生物学检验

沙眼衣原体的分子生物学检验--介绍沙眼衣原体的基因组结构特征，分子生物学检测方法以及分子生物学的检验的临床意义。肺炎衣原体的分子生物学检验--介绍肺炎衣原体的基因组结构特征，分子生物学检测方法以及分子生物学的检验的临床意义。

●8.2支原体的分子生物学检验

肺炎支原体的分子生物学检验--介绍肺炎支原体的基因组结构特征，分子生物学检测方法以及分子生物学的检验的临床意义。

●8.3原虫的分子生物学检验

弓型虫的分子生物学检验--介绍弓型虫的基因组结构特征，分子生物学检测方法以及分子生物学的检验的临床意义。

第九章单基因遗传病的分子生物学检验技术

单基因遗传性疾病是由于某种发生突变引起的疾病，常见的基因突变类型有缺失、插入、易位、点突变等。对异常基因的分子诊断方法主要包括：RFLP分析技术、多重PCR技术、PCR-ASO技术、PCR-SSCP技术、PCR-STR分析技术、Southern印迹技术、AS-PCR技术、DNA芯片技术、VNTR等。针对不同的基因结构特点可选用不同的分析技术，多种技术的联合应用可防止漏诊的发生。

●9.1镰状红细胞贫血的分子生物学检验

镰状细胞贫血是由于β珠蛋白基因错义突变引起的疾病，在黑人人群中有极高的发病率和死亡率，属于常染色体隐性遗传性疾病。我国广东、广西、福建、浙江等地均有发现，在东南亚地区居住的华侨发病者也不少。

●9.2地中海贫血的分子生物学检验

地中海贫血是由于组成血红蛋白的某种肽链的合成速率降低，而另一种珠蛋白链的合成相对过剩，导致该类红细胞中的血红蛋白四聚体组成和结构发生改变，进而引起的溶血性贫血。

●9.3血友病的分子生物学检验

血友病是一组因遗传性凝血活酶生成障碍引起的出血性疾病。其临床表现为反复自发性或轻微损伤后出血不止，血肿形成及关节出血为特征的出血现象。

第十章肿瘤的分子生物学检验技术

肿瘤是危害人类健康的一大杀手。由于我国人口基数庞大，人口逐渐老龄化，以及吸烟、感染、环境污染等问题的突出，更加剧了我国在恶性肿瘤预防、诊断及治疗方面的挑战。自20世纪50年代以来，随着分子生物学的发展，肿瘤分子生物学成为肿瘤学基础研究领域最活跃的学科，极大的促进了人们对肿瘤的发生发展及转归机制的了解和认识。肿瘤分子生物学检验的发展，使肿瘤的分子生物学检验受到了人们的高度关注并被广泛用于肿瘤的临床诊疗工作中。目前，肿瘤的分子生物学检验在临床上除了用于肿瘤的早期诊断，还在肿瘤易感性筛查、肿瘤分型、侵袭迁移、预后判断和靶向治疗等方面有重要作用。本章就肿瘤的分子生物学相关概念和在肿瘤诊疗中的应用进行介绍，重点关注肿瘤的分子生物学检验方面的成果。

●10.1肺癌的分子生物学检验

肺癌是目前全世界发病率最高的恶性肿瘤之一，长时间以来，科学家们将肺癌的发生归结为环境的变化和吸烟。但随着研究的深入，肺癌的遗传易感性也越来越受到人们的重视。本节课就主要来介绍有关于肺癌的遗传易感性基因家族和有关于肺癌的分子生物学检验策略。

●10.2乳腺癌的分子生物学检验

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。目前，研究发现基因的改变与乳腺癌的发生发展密切联系，本节课就主要介绍与乳腺癌相关的易感基因以及常用的分子生物学检验技术。

●10.3白血病的分子生物学检验

白血病的分子生物学检验已较早进入临床常规诊断，其在临床诊疗、治疗方案的选择、预后判断、发现微小残留病变以及探索发病原因等方面正发挥着越来越重要的作用，尤其是在白血病分型方面。本节课就主要介绍分子生物学检验技术的介入，在准确反映白血病疾病的本质、发病机制，并有效指导临床治疗方案的制定和预后判断方面发挥的重要作用。

●10.4 结直肠癌的分子生物学检验

结直肠癌是世界上最常见的三大恶性肿瘤之一，并呈稳定增长趋势。其发生存在明显的地域趋势，呈现出与工业化进程和经济发达水平相一致的阶梯分布。研究发现，结直肠癌是至今遗传背景最强、研究最为深入的一类恶性肿瘤，绝大多数结直肠癌的发生、发展是一个多步骤、多阶段、多基因共同参与的过程，是外在环境和机体内在遗传因素相互作用的结果。本节课主要介绍个体特异的遗传易感性在结直肠癌发生中的重要意义以及常见的结直肠癌分子生物学检验技术。