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第一章基因工程概述
基因工程技术是发展最快，最前沿的生物技术之一。本章介绍基因工程技术的概念、原理、应用领域；诞生的历史过程，展望发展方向；并简述其基本流程。
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●1.1认识转基因
什么是转基因？转基因与杂交育种有何不同？利用基因工程技术研制的新冠疫苗有那几款？基因工程技术在各个领域中发挥着怎样的作用？这一节内容将带你走进基因工程，认识转基因。
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●1.2基因工程技术的诞生
基因工程是以分子生物学、遗传学、微生物学等多个学科为基础的一门科学，可以说它是站在了巨人的肩膀上。这一节将为你介绍奠定基因工程技术诞生的，在科学史上具有里程碑意义的发明和成就。
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●1.3基因工程技术基本流程
基因工程是一项怎样的工程呢？其操作过程包括哪些步骤？本节将为你介绍基因工程操作的经典流程。
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第二章基因与基因的表达调控
基因工程的操作对象是“基因”，无论是原核表达，还是真核表达，“外源基因”到“重组蛋白质”的过程都会经历一系列的调控。要想利用好基因工程技术，我们首先需要对生物体中的“基因”及其表达调控了然于心。
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●2.1基因的结构与功能
原核生物与真核生物的基因组在诸多方面都是不同的，包括复杂程度，数量和结构等。
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●2.2原核生物的基因表达调控
原核生物通过启动子、RNA聚合酶、终止子等元件来调控基因的表达，并通过操纵子对外界环境的变化作出响应。以乳糖操纵子为例，介绍了该操纵子的结构和基因调控机制。
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●2.3真核生物的基因表达调控
真核生物基因的表达调控更多复杂和多元，从DNA到有功能的蛋白质，涉及7个层次，3个不同水平上（DNA水平、RNA水平和蛋白质水平）的调控。
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第三章基因工程的工具酶
基因工程技术的诞生与发展，得益于各种强有力的工具酶。本章将为你介绍几种主要工具酶（包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、碱性磷酸酶等）的性质、作用特点和应用等。
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●3.1限制性核酸内切酶
20世纪50年代，科学家从微生物中分离得到了II型限制性核酸内切酶，为基因工程技术的诞生奠定了重要基础。本节主要介绍II型限制性核酸内切酶的主要性质和特点，以及比较特殊的同裂酶与同尾酶。
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●3.2酶切体系的建立
限制性核酸内切酶的主要作用是“切”，切目的基因、切质粒，使两者能够构建成重组质粒。本节将为你介绍如何建立酶切体系，以及影响酶切反应的主要因素。
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●3.3DNA连接酶
DNA连接酶可将两个DNA分子进行连接，在基因工程中同样具有举足轻重的作用。本节为你介绍DNA连接酶的作用特点、主要的种类、以及基因工程中DNA分子的常用连接策略。
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●3.4DNA聚合酶
DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化dNTP聚合生成新的DNA链。在本节中，你将了解到基因工程中常用的DNA聚合酶以及它们各自的功能和应用。
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●3.5DNA修饰酶
除了酶切、连接和聚合，基因工程中的DNA分子往往还需要“修修补补”，比如去除磷酸根基团，防止DNA分子环化或自连的碱性磷酸酶；为平末端的DNA分子加上多聚体尾巴的末端脱氧核苷酸转移酶；用于特异去除体系中的DNA或RNA链的核酸酶等。
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●3.6其他工具酶
基因工程中不断有其他的工具酶被发现和应用，使基因工程的操作更加快捷而方便。本节将为你介绍用于“无缝克隆”的IIs型限制性核酸酶；用于条件基因敲除的Cre/FLP重组酶；以及开创新基因编辑时代的Cas核酸内切酶。
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第四章基因工程中的载体
一段外源DNA分子如何进入受体细胞，并获得稳定遗传和表达呢？答案是：需要相应载体的介导。本章将详细介绍基因工程中的各类载体。
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●4.1质粒载体
天然质粒存在于细菌细胞中，为环状小型DNA分子，具有自主复制的能力。基因工程中的质粒载体经天然质粒改造而来，其应具备哪些条件？常用的质粒载体又具有哪些特点呢？
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●4.2噬菌体载体
相比较质粒载体，噬菌体作为载体可携带更大的外源DNA分子。本节介绍作为载体的噬菌体的特点、类型和应用。
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●4.3柯斯质粒载体
黏粒载体，也称柯斯质粒，是由质粒与噬菌体的cos黏性末端构建而成的。它作为载体又具有怎样的优缺点呢？
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●4.4人工染色体
从质粒载体，噬菌体载体，再到黏粒载体，可承载外源DNA分子的上限分别约为10kb，20kb，以及40kb。但是依然无法装载庞大的动植物基因组，直到20世纪80年代，科学家构建了第一个酵母人工染色体YAC。
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●4.5酵母表达载体
酵母作为真核生物，以其为受体细胞的表达系统能对重组蛋白进行翻译后修饰，可分泌到培养基中等特点；同时培养方便，成本低，因此是基因工程中常用的表达系统。本节将介绍酵母表达系统中常用的各类载体的特点、组成等。
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●4.6哺乳动物表达载体
哺乳动物细胞表达系统产生的重组蛋白具有更加天然的结构与活性，常被用作基因工程药物的生产平台。哺乳动物表达载体可以是质粒载体，也可以是病毒载体。本节主要介绍包括逆转录病毒、腺病毒载体在内的病毒载体。
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●4.7读懂质粒
克隆质粒、表达质粒；原核表达质粒、真核表达质粒；基因工程中质粒种类繁多，组成不同，用途也各不相同。本节将为你介绍不同类型质粒的基本组成，以及质粒的解读方式。
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第五章目的基因的获取与制备
在基因工程中，目的基因是指来源于某一生物的一段核苷酸序列，将其导入受体细胞中表达相应的蛋白质或多肽。那么目的基因如何获取呢？本章将介绍常用的获取与制备方法，包括从基因组文库中获取，从cDNA文库中获取，PCR扩增法获取等。
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●5.1基因组文库的构建
基因组文库是人工构建的某一生物体的所有DNA信息的集合体，是获取该生物某一特定基因序列的有效来源。本节将为你介绍如何制备基因组文库，以及如何通过菌落原位杂交获得目的基因。
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●5.2cDNA文库的构建
对于真核生物而言，由于其基因组的庞大与复杂，通过构建简化的cDNA文库来获取目的基因是更为常用的方法。本节将为你介绍cDNA文库构建的方法，以及利用其获得目的基因的优点。
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●5.3PCR获取目的基因
PCR技术于1985年诞生，被广泛应用到生物技术的各个领域，发挥了无与伦比的重要作用，也是获取和制备目的基因最为常用的方法之一。本节从目的基因克隆的角度介绍了PCR基本原理、体系和程序。
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●5.4反转录PCR
除了常规PCR，更多的PCR技术被不断发展和创新，如利用mRNA为模板合成cDNA的反转录PCR，以及反向PCR、多重PCR、巢式PCR、不对称PCR等。在扩增目的基因的道路上，可谓八仙过海，各显神通。
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●5.5荧光定量PCR
荧光定量PCR并不是用于获得目的基因的方法，但因其简单快捷、可实时定量的优点，被迅速而广泛地应用在各个领域中。本节介绍该技术的基本原理、方法和应用。
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●5.6基因定点突变技术
无论是研究蛋白质结构与功能；还是想要改造蛋白质，使其获得更好更优的性质；基因定点突变技术是有效的途径。本节介绍基因定点突变技术的发展过程和三种主要的技术类型。
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●5.7T-A克隆和酶切位点的引入
通过各种方法获得目的基因之后，如何将其与载体相连呢？通过PCR扩增的目的基因，可通过T-A克隆连接到各类T载体上；也可引入酶切位点，通过酶切连接到相应载体上；本节将为你介绍这些方法，并通过实例加深理解。
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第六章目的导入受体细胞
重组DNA分子在体外构建成功之后，需要导入受体细胞中才能被克隆和表达。不同的载体、不同的受体细胞，导入的方法也不同。本章将为你介绍重组DNA分子导入受体细胞的各种方法。
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●6.1导入大肠杆菌
大肠杆菌是最为方便和成熟的原核表达系统宿主菌，被广泛使用。外源DNA导入大肠杆菌的方法主要为“转化”。本节主要介绍了大肠杆菌感受态细胞的制备，以及热激转化法和电穿孔转化法。
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●6.2导入酵母细胞
酵母是外源真核基因最理想的表达系统，其优势有哪些？酵母表达菌株有哪些？本节还主要介绍了聚乙二醇介导和金属阳离子介导的酵母转化方法。
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●6.3导入植物细胞-Ti质粒
农杆菌被称为“自然界最小的遗传工程师”，而赋予其这项能力的是由于其中的Ti质粒。本节将为你介绍Ti质粒的发现历史，结构组成，基因工程中对Ti质粒的改造和利用其将外源DNA导入植物细胞的机制。
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●6.4导入植物细胞
除了农杆菌Ti质粒的介导法，外源DNA导入植物细胞还可以通过DNA直接转移法，包括原生质体法、基因枪法、花粉管通道法等。
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●6.5导入动物细胞
动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为外源基因的受体细胞，具有很多优势。外源基因导入动物细胞的方法也有很多。本节分别介绍了导入离体培养动物细胞的方法和导入受精卵、胚胎干细胞等活体动物细胞的方法。
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第七章阳性转化子的鉴定
重组DNA分子导入受体细胞后，只有那些含有外源目的基因，并且能够被克隆和稳定遗传的，才是阳性转化子。筛选和鉴定阳性转化子是基因工程的重要环节。
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●7.1遗传表型检测法
利用遗传表型筛选阳性转化子是最常用的方法，存在于载体上的筛选标记包括：抗药性基因、酶类基因、可以这届观察的发光蛋白基因等。
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●7.2PCR与酶切电泳检测法
遗传表型检测的标记主要存在于载体分子上，有时候并不能准确鉴定到阳性转化子。而PCR和酶切电泳的检测是在此基础上的进一步筛选，可以更准确地鉴定外源目的基因的插入位置是否正确。
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●7.3DNA测序技术
DNA测序是最直观且准确的鉴定阳性转化子的方法。从一代测序、二代测序，到三代单分子测序和单细胞测序，DNA测序技术在短短几十年时间里经历了突飞猛进的发展。本节为你介绍DNA测序技术的发展、原理和应用。
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●7.4Southern & Northern blot
Southern和Northern blot是应用广泛的核酸分子杂交技术。本节介绍这两种分子印迹杂交技术的原理、流程和在基因工程中的应用情况。
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●7.5核酸探针的制备
核酸探针包括DNA探针和RNA探针；探针的标记类型可以是放射性标记，也可以是生物素、地高辛、荧光素等非放射性标记；而探针的制备与标记的方法也有很多，如切口平移法、随机引物法等等。
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●7.6Western blot
不同与Southern和Northern blot，Western blot是一种免疫学检测方法，通过抗原抗体反应来检测目的基因的表达情况，也广泛应用于生命科学研究的各个领域。本节介绍该方法的原理、操作流程及应用。
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第八章外源基因的诱导表达和产物纯化
外源目的基因如何在受体细胞中进行表达呢？表达产物又如何被分离纯化？基因工程中，由于载体类型的不同，重组蛋白可以在一定条件下被诱导表达；也可以形成融合蛋白进行表达；或分泌到培养基中进行表达。本章将为你一一介绍重组蛋白的这些不同的表达方式。
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●8.1诱导表达系统
诱导表达系统可以更加高效而可控地使外源重组蛋白进行表达。本节将为你介绍大肠杆菌、酵母细胞以及动植物细胞中的诱导表达系统。
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●8.2融合蛋白表达系统
融合蛋白表达系统可以增加重组蛋白的可溶性、提高表达率、通过添加标签便于分离纯化等优点。本节讨论各种不同类型的融合蛋白表达系统。
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●8.3分泌型表达
重组蛋白可分泌表达到培养基中，从而方便地分离纯化。怎样可以使重组蛋白以分泌型表达呢？大肠杆菌表达系统、酵母表达系统中有哪些载体可用于分泌型表达呢？
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●8.4重组蛋白的分离纯化
基因工程中有不同类型的蛋白表达系统，所形成的重组蛋白可能是包涵体形式，也可能可溶性表达；可能分泌到培养基中，也可能存在细胞内。本节介绍面对不同类型的重组蛋白所能选用的分离纯化策略。
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第九章基于基因工程技术的基因功能研究
随着进入后基因组时代，基因功能的研究成为生命科学领域重要的研究内容，基因工程技术在此研究中发挥着重要的作用。本章介绍了完全基因敲除和条件基因敲除技术；锌指核酶和TALEN基因编辑技术；CRISPR-Cas系统在基因功能研究中的应用。
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●9.1完全基因敲除技术
完全基因敲除技术创建与1987年，开启了反向遗传学研究基因功能的时代，也开启了利用胚胎干细胞编辑生物体基因的时代。本节介绍完全基因敲除技术的诞生、流程以及优缺点。
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●9.2条件基因敲除技术
条件基因敲除技术可以使基因在特定组织、器官，或特定发育阶段、不同生理条件下被敲除。本节介绍实现条件基因敲除的几个系统，包括Cre-LoxP和FLP-FRT重组酶系统、四环素诱导系统、他莫昔芬诱导系统。
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●9.3锌指核酶和TALEN基因编辑技术
与传统基因打靶技术不同，锌指核酶和TALEN基因编辑技术不依赖于同源重组，也不受胚胎干细胞的限制，属于新一代基因编辑技术。本节介绍这两类基因编辑技术的技术特点、原理和应用。
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●9.4CRISPR基因打靶系统
CRISPR打靶系统以其史无前例的高效和便捷被称为基因打靶神器，该项技术的两位主要创建者荣获了2020年诺贝尔化学奖。本节介绍CRISPR打靶系统的发展过程，以及为此做出贡献的各位科学家，并阐述了该系统的工作原理和应用。
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第十章转基因技术的应用与安全性
转基因植物和转基因动物是基因工程的终产品或基因工程产物的承载者。转基因动植物带来巨大的社会效益和经济效益的同时，也产生了很多的争议。本章介绍转基因动植物的发展历程，相关技术，安全性评价等问题。
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●10.1转基因植物的发展历程
1983年，世界上第一例转基因烟草诞生，之后，美国的孟山都公司相继研发了转基因土豆、转基因玉米等转基因作物。至今全球已有30多个国家批准数千例转基因作物进行田间试验。本节将为你介绍转基因作物不断发展的过程，以及全球，包括我国转基因作物的种植现状。
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●10.2转基因植物的类型
转基因作物的类型有抗除草剂、抗虫、提高抗病力等。本节介绍转基因作物的主要类型，转入的基因类型，以及基因产物的作用机制等问题。
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●10.3转基因动物概况
20世纪80年代，随着真核生物基因的表达与调控研究的深入，以及病毒载体和转染技术的成熟，转基因动物技术逐渐发展起来。本节介绍了转基因动物的发展过程，转基因动物在提高动物自身品质、建立疾病模型和用于生物制药等领域中的应用概况。
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●10.4转基因动物技术
转基因动物如何制备呢？本节介绍了几种外源基因转入动物细胞的方法，主要包括显微注射法、胚胎干细胞介导法、以及体细胞克隆法等。
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●10.5转基因技术的安全性评价
转基因植物一经问世就引来诸多争议。本节将与你探讨转基因作物对环境和对人类健康的影响；介绍评价转基因作物安全性的几大原则；引导大家理性、科学看待转基因技术。